与CRISPR/Cas系统相爱相杀的抗CRISPR蛋白研究最新进展

科学家可以通过基因工程识别致病基因。这涉及将人造DNA添加到细菌细胞中。然而,问题是细菌已经进化出复杂的防御系统以防止外来入侵者

特别是外来的DNA。目前的基因工程方法经常将人造DNA伪装成细菌DNA以阻止这些防御,但是该过程需要高度特异性的修改并且昂贵且耗时。

在最近发表在美国国家科学院院刊上的一篇论文中,克里斯托弗约翰斯顿博士和他在Forsyth研究所的同事们描述了一种通过使人造DNA对细菌的防御不可见而对细菌进行基因工程的新技术。理论上,该方法可以应用于几乎任何类型的细菌。

Johnston是Fred Hutchinson癌症研究中心疫苗和传染病部门的研究员,也是该论文的主要作者。他说,当一个细菌细胞检测到它已被外来DNA穿透时,它会迅速摧毁侵入者。细菌一直受到病毒攻击的威胁,因此它们已经开发出非常有效的防御措施来抵御这些威胁。

约翰斯顿解释说,问题在于,当科学家们想要将人造DNA放入细菌中时,他们会面对完全相同的防御系统,以保护细菌免受病毒侵害。

为了克服这个障碍,科学家们添加了特定的修改来掩盖人造DNA并诱使细菌认为入侵者是其自身DNA的一部分。这种方法有时可行但可能需要相当长的时间和资源。

约翰斯顿的策略是不同的。他没有在人造DNA中加入伪装,而是删除了一种称为基序的基因序列的特定成分。细菌防御系统需要这个主题来识别外来DNA并进行有效的反击。通过去除基序,人造DNA变得对细菌的防御系统基本上是不可见的。

必发官网下必发官网下载 ,想象一下像干船坞中的敌人潜艇这样的细菌,以及作为你的士兵的人造遗传工具,需要进入潜艇进行特定的任务。目前的做法就像将间谍伪装成敌人一样士兵,让他们走到每个门口,允许警卫检查他们的凭据,如果一切顺利,他们就在,约翰斯顿说。我们的方法是让那名士兵看不见,让他们直接穿过大门,完全躲避守卫。

这种新方法比现有技术需要更少的时间和更少的资源。在这项研究中,约翰斯顿使用金黄色葡萄球菌作为模型,但他开发的潜在策略可以用于潜行这些主要的防御系统,这些系统存在于当今已知的80%至90%的细菌中。

这种新的基因工程工具为以前未经过充分研究的细菌研究开辟了可能性。约翰斯顿解释说,由于科学家的时间和资源有限,他们倾向于使用已经被破坏的细菌。使用这种新工具,解决细菌DNA的主要障碍已经解决,研究人员可以使用该方法设计更多临床相关细菌。

细菌是我们这个星球的驱动力,Forsyth研究所的高级研究员,该论文的共同作者Gary Borisy博士说。设计细菌的能力对医学,农业,化学工业和环境都有深远的影响。

除了我们的系统在蛋白质识别水平上起作用外,虫子的免疫系统与我们的效率一样有效,而CRISPR在核酸识别水平上起作用,分子生物学和遗传学教授Ailong Ke解释道。

2016年7月25日,国际学术权威刊物自然出版集团旗下子刊《Nature Structural & Molecular Biology》杂志上在线发表了浙江大学生命科学研究院朱永群实验室题为“Structural Basis for Cas3 Inhibition by the Bacteriophage Protein AcrF3”的研究论文,研究揭示噬菌体蛋白AcrF3抑制病原菌I型CRISPR-Cas免疫系统效应分子Cas3的分子机理。国家蛋白质科学中心的姚德强博士和朱永群实验室博士生王小飞为论文共同第一作者,朱永群教授和助理研究员周艳博士为本文的共同通讯作者。

▲CasX的结构组成

必发官网下必发官网下载 1

到目前为止,I型CRISPR为精确基因编辑提供了有限的实用性,但它可以用作对抗抗生素抗性细菌菌株的工具。

在一项新的研究中,来自加拿大多伦多大学和新西兰奥塔哥大学的一个研究团队发现多样性的细菌物种编码阻断特异性CRISPR/Cas系统活性的基因。通过扫描原噬菌体,来自多伦多大学的Alan Davidson和同事们鉴定出5种新的抗CRISPR蛋白编码基因,而在此之前,他的团队已鉴定出9种。这项最新的研究突出强调了一种学习CRISPR系统如何工作的方法以及一种潜在的开展基于CRISPR的基因编辑的附加工具。相关研究结果于2016年6月13日在线发表在Nature Microbiology期刊上,论文标题为“Inactivation of CRISPR-Cas systems by anti-CRISPR proteins in diverse bacterial species”。

论文第一作者Jun-Jie Liu和Natalia Orlova使用冷冻电镜捕捉到了CasX蛋白在编辑基因过程中的快照图像,基于这种蛋白质独特的分子组成和形状,研究人员得出结论,CasX的进化独立于Cas9,没有共同的祖先。

细菌无处不在。他们生活在土壤和水中,皮肤上和身体中。有些是致病的,这意味着它们会引起疾病或感染。为了设计针对病原体的有效治疗方法,研究人员需要知道哪些特定基因应归咎于致病性。

必发官网下必发官网下载 2

这些抗CRISPR蛋白的多样性序列和作用机制代表它们具有各自独立的进化过程,同时提示可能还会存在其他可能调控CRISPR-CAS功能的蛋白,仍然需要更多研究进行深入探讨。2. Cell:赞!又发现两种新的抗CRISPR蛋白doi:10.1016/j.cell.2016.12.009

“首先值得注意的是,这些高度特异性的结构域是如何发挥类似于他们在其他RNA引导的DNA结合蛋白中所观察到的作用。CasX的最小尺寸有助于清楚地展示其在自然界中使用的基本配方。”Oakes说,“了解这个配方将帮助我们更好地进化和设计基因组编辑工具,以达到我们的目的,而不是自然的目的。”

  • 特别是它如何搜索其DNA靶标 - 尚不清楚,并且引起了对非预期的脱靶效应以及使用CRISPR-Cas机制治疗人类疾病的安全性的担忧。

Davidson和同事们然后测试了在质粒中表达的每种假定的抗CRISPR基因是否能够支持噬菌体在携带靶向它的I-E型或I-F型CRISPR系统的细菌内复制。他们又鉴定出4种靶向作用于I-F型CRISPR系统的抗CRISPR基因,以及一种能够阻断I-E型和I-F型CRISPR系统的抗CRISPR基因。4.mBio:鉴定出新的一组抑制铜绿假单胞菌I-E型CRISPR-Cas系统的噬菌体抗CRISPR基因doi:10.1128/mBio.00896-14

实际上,CasX是细菌和人类细胞中潜在的一种有效基因编辑工具,其似乎是在细菌中进化出的独立于其它Cas蛋白的一种特殊蛋白,CasX能够切割双链DNA,结合DNA并调节基因的表达,同时还能靶向作用特殊的DNA序列。由于CasX来自于细菌细胞中,因此相比Cas9而言,人类机体免疫系统或许能够更加容易地接纳CasX。

柯与哈佛医学院细胞生物学助理教授廖茂夫合作,他是一位使用低温电子显微镜确定在冰层中冷冻的大分子高分辨率结构的专家。使用用于发酵的细菌Thermobifida fusca,Ke的实验室制备了代表免疫反应的不同阶段的样品。廖和他的博士后研究员罗敏冻结了这些样本,并在每一步拍摄了高分辨率的快照。该研究的重点是特定版本的CRISPR相关防御,称为IE型。

马萨诸塞大学医学院RNA治疗研究所教授Erik J. Sontheimer博士、多伦多大学分子遗传学教授Alan Davidson博士和多伦多大学生物化学助理教授Karen Maxwell博士鉴定出三种自然产生的抑制Cas9核酸酶的蛋白。这些被称作抗CRISPR的蛋白具有阻断Cas9切割DNA的能力。

2012年6月, Doudna率先拉开第三代基因编辑技术CRISPR-Cas9的大幕,但在随后的专利竞争中,一度被麻省理工学院和哈佛大学的博德研究所张锋团队占尽优势。

科学家们假设这些状态存在,但他们缺乏视觉证明它们的存在,罗说。现在,看到真的相信。

朱永群实验室建立了PaCas3体外核酸酶酶学实验体系,发现PaCas3具有很好的多种二价金属离子依赖的核酸酶活性。进一步的生化实验揭示AcrF3蛋白在溶液状态下形成同源二聚体分子,以高亲和力的方式与PaCas3特异地结合,有效地抑制了PaCas3体外核酸酶活性。通过解析2.6埃高分辨率的PaCas3-AcrF3复合物的晶体结构,该研究发现PaCas3由一个独立的N端Cas2结构域、HD型核酸酶结构域、SF2型解旋酶结构域、Long linker区以及C端结构域所构成。单独的Cas2蛋白被报道在CRISPR-Cas免疫系统的DNA adaptation过程中发挥关键作用,Cas2与Cas1形成摩尔比2:4的整合酶复合物,将获取的外源DNA插入CRISPR基因座中。PaCas3拥有独立的Cas2结构域,说明PaCas3不同于以往报道的Cas3分子,它同时参与了CRISPR-Cas系统中的DNA适应和DNA干扰两个过程。

CasX具有不同于此前几款Cas核酸酶的独特优点。

我们大致知道它的工作原理,但没有结构,我们没有细节,柯说。一张图片胜过千言万语。

在PaCas3-AcrF3复合物晶体结构中,AcrF3以同源二聚体的方式与PaCas3的紧密结合,这与我们的生化实验结果完全一致。单个AcrF3分子呈现由六股α-螺旋组成的双层结构,并通过疏水相互作用、以反向对称的方式形成同源二聚体分子。破坏二聚体中两个分子之间的疏水作用,将导致AcrF3完全丧失了抑制PaCas3体外核酸酶活性的能力。在复合物结构中,AcrF3二聚体结合在PaCas3 的位于Long linker区与CTD结构域之间的凹槽区域,并与PaCas3的HD、Long linker区、RecA2和CTD结构域之间发生了广泛的相互作用。其中,AcrF3与RecA2之间的相互作用完全封闭了PaCas3解旋酶结构域中DNA结合通道的入口,说明AcrF3的结合导致PaCas3不能接触由Cascade呈递来的目标DNA。令人惊讶的是,在复合物结构中,PaCas3解旋酶结构域结合了一个ADP分子,而不是通常活性解旋酶结合的ATP分子,表明AcrF3将PaCas3锁定在非活性的状态。通过进一步的结构分析,该研究还发现AcrF3也阻止了Cascade复合物的Cse1亚基对PaCas3的识别作用,导致Cascade不能招募PaCas3。因此,AcrF3蛋白以同源二聚体为活性单元,通过屏蔽PaCas3对目标DNA的接触、阻断Cascade复合物Cse1亚基对PaCas3的招募作用以及将PaCas3锁定在ADP结合的非活性状态,从而抑制I型CRISPR-Cas免疫系统,发挥其anti-CRISPR活性。

Doudna率领的研究团队此番开发出的CasX证明了在原生细菌之外也能发挥作用。其设计类似于Cas9和 “表亲”Cas12,但不同之处在于,它似乎是独立于其他Cas蛋白在细菌中进化而来的。它可以像Cas9一样切割双链DNA,可以结合DNA调节基因,也可以像其他Cas蛋白一样靶向特定的DNA序列。

通过拍摄一系列近原子分辨率的快照,康奈尔大学和哈佛医学院的科学家们一步一步地观察了细菌如何抵御外来入侵者,如噬菌体,一种感染细菌的病毒。

为了研究 AcrIIA2 或 AcrIIA4 是否能够直接结合 SpyCas9,课题组首先建立体外生物化学研究系统,研究发现 Anti-CRISPR 蛋白 AcrIIA2 或 AcrIIA4 直接结合 SpyCas9-sgRNA 复合物,有趣的是 AcrIIA2 或 AcrIIA4 只和结合有 sgRNA 的 SpyCas9 有相互作用,而和单独 SpyCas9 并没有相互作用;进一步实验发现 AcrIIA2 或 AcrIIA4 能够直接抑制 SpyCas9 介导的目的 DNA 的剪切。

日前,美国加州大学伯克利分校Jennifer Doudna作为通讯作者之一在国际顶级学术期刊《自然》杂志发表一项最新研究:一种新型的小型CRISPR基因编辑工具CasX,CasX与蛋白Cas9较为相似,但比Cas9小很多。这是时隔7年之后,Doudna再次开发出新型基因编辑工具,或可和此前的Cas9形成有力竞争。

Ke和Xiao与同一期Cell杂志合着了另一篇论文,与德克萨斯大学奥斯汀分校生物科学助理教授Ilya Finkelstein一起描述了Cascade如何在单分子水平上搜索目标。

他们首次证实铜绿假单胞菌的I-E型CRISPR-Cas系统无需基因操纵就天然地具有活性,这与之前描述过的大肠杆菌和其他细菌的I-E型CRISPR-Cas系统形成鲜明对比。5.Cell:重磅!揭示抗CRISPR蛋白阻断CRISPR系统机制doi:10.1016/j.cell.2017.03.012

此外,由于它来自于人类不存在的细菌,Banfield从地下水和沉积物中发现的微生物数据库中提取了它们,人类免疫系统应该比Cas9更容易接受它。一些医生一直在担心,在使用CRISPR治疗的患者中,Cas9可能会产生免疫反应。

生物学家使用CRISPR进行基因工程实验,但细胞可能已经将这种机制演变为防御系统的一部分。细胞使用这些位置来存储入侵者的分子记忆,以便在下次遭遇时可以选择性地根除它们。

这项研究发现两种蛋白抑制剂AcrIIA2和AcrIIA4阻断来自酿脓链球菌的Cas9酶活性,其中Cas9是一种经常用于基因组编辑中的DNA切割酶。3.Nat Microbiol:微生物利用抗CRISPR蛋白破坏CRISPR/Cas系统doi:10.1038/nmicrobiol.2016.85

CasX由Doudna和加州大学伯克利分校另一名科学家Jill Banfield两年前在一些世界上最小的细菌中发现,这种蛋白质与Cas9类似,但比Cas9小得多:如果你想把基因编辑器植入细胞,这是一个很大的优势。