科学家利用多重Crispr基因编辑技术建立癌症药筛新模型

根据美国癌症协会的数据,预计2019年将有11,000人死于急性髓性白血病(AML)。癌症始于骨髓。在那里,突变的基因不能阻止血细胞一次又一次地复制,增加肿瘤。

利用CRISPR-Cas9进行全基因组筛选找到胰腺肿瘤弱点:2016年11月,来自加拿大多伦多大学的研究人员在RNF43突变的胰腺导管腺癌细胞中进行了全基因组范围的CRISPR-Cas9筛选,并找到了可以用于治疗该类型癌症的潜在抗体药物。

CRISPR技术利用DNA切割酶Cas9,在指导RNA序列的帮助下,发现和修饰遗传靶标。科学家可以使用标准分子生物学技术轻松设计多种新的指导RNA。这使得修改任何物种中任何细胞类型的基因组的方法更加快速有效。

Zuzana Tothova博士说:“使用多重CRISPR技术了对人造血干细胞进行基因编辑,随后移植进入小鼠中,定制生成的这种小鼠模型可用于白血病的研究。在许多不同的实验中,动物模型可以成功的反映用于治疗血液肿瘤制剂的反应。 而通过我们的模型,可以在正确的环境中以非常受控的方式进行测试,并使用正确的细胞,这些细胞包含了对特定药物反应的遗传预测基因。”

bifa9999.com ,化学疗法帮助三分之二的患者达到缓解。最近,药物开发人员设计了一种新的攻击方法,旨在针对患者的故障基因,回收其被劫持的细胞,并停止生长。但是这种药物开发会导致试验中出现更多错误,并且可能需要数年时间才能从实验室到患者。

CRISPR在遗传学中的应用

该研究小组针对26种已知与该细菌毒素受体合成有关的基因。他们发现这些基因中有17个是抵抗力的原因。重要的是,他们还发现了以前未知的基因,这些基因的突变赋予对这种毒性剂的抗性。

到目前为止,还没有人用多重CRISPR技术对人造血干细胞进行编辑,添加特异性突变以产生疾病模型。之后,研究人员将编辑过的干细胞注入小鼠的血液循环系统,其中一部分进入骨髓。该小组在五个月后监测其进展情况,然后提取细胞进行测序,以确定这些编辑后的细胞已经成功繁殖。

Liau揭示了为什么某些AML药物只能在某些时候起作用。利用他的新技术,Liau和团队揭示了关于药物

身体关系的更多私密细节,并且在此过程中,反驳了先前关于AML药物如何起作用的假设。

药物 - 身体关系

为了测试一种新药,开发人员操纵他们产品的小分子,转移它们以了解这些变化如何影响药物的功效。

为了研究AML药物如何起作用,Liau小组遵循相同的过程。但是,就像一个好的调解人一样,他们也在追逐故事的另一面:如果我们操纵蛋白质目标,他们想知道会发生什么?

作为化学家,我们几乎可以做任何事情,Liau说。现在,我们拥有了前所未有的能够直接在细胞中系统地改变蛋白质结构的能力。

对于他们的第一次调解,Liau小组专注于AML的特定亚型,其突变的基因导致血细胞的所谓的表观遗传状态的转变。表观遗传变化,其中化学标签落在基因上并打开或关闭它们,是由环境触发因素引起的

  • 你吃什么,运动和睡眠多少,以及你住在哪里,都会影响你的表观基因组。

在AML中,突变基因足以引发表观遗传变化并重新编程细胞以不受控制地生长。由于酶通常调节基因与其宿主细胞之间的对话,新药靶向这些蛋白质,希望能够逆转它们的故障。对于AML,该酶靶标称为LSD1(赖氨酸特异性组蛋白脱甲基酶1)。

到目前为止,LDS1靶向药物有时只起作用。所以,Liau和他的团队决定揭开是什么让这种蛋白质变得如此滑溜。

开发弱点

像自行车一样,蛋白质具有必需和非必需部分(或域)。没有把手,机器一直在移动;没有轮子,它停止。因此,Liau小组搜寻了LSD1的轮子,一旦拆除,它将停止蛋白质和疾病。

为此,该团队使用了一项名为CRISPR扫描的技术。基因编辑工具CRISPR可以精确切割遗传密码(DNA)。因此,Liau小组使用该工具同时在许多AML相关基因中执行系统但随机的切片。

然后,当细胞进入修复切口时,基因组中就会形成微小的疤痕。这些疤痕产生各种突变基因,突变基因产生突变蛋白。一个突变体失去了把手,另一个踏板,最终,一个失去了它的轮子。即使前两种蛋白质丢失了一些部分,它们的癌细胞依然存在。但是最后一个是固定的;增长关闭。

通过他们的系统方法,Liau小组可以分类药物开发人员可以利用哪些LSD1弱点。精心设计的药物可以像齿轮辐条中的鹅卵石一样:阻碍机器的一种小而有效的方法。

BUMPS和HOLES

一些突变可以强化而不是减弱:蛋白质可能会获得一组不受药物影响的新轮子。

为了确定哪些突变可能会阻碍药物疗效,Liau小组研究了药物如何与每种突变体相互作用(一种叫做CRISPR抑制扫描的技术)。一些突变体再次死亡,而其他突变体继续恶性生长。开发人员可以利用这些信息调整他们的药物并破坏蛋白质的新防御。

也许我在药物上添加一些东西,比如让它更大或增加一个凹凸,Liau说。或许我可以在蛋白质上添加一些东西,比如一个洞。如果凹凸孔相互补充,我们可以用这种方法来区分这些信息。

使用CRISPR抑制扫描,他的研究小组探讨了颠簸和空洞如何影响AML突变体LSD1与目前正在开发的治疗癌症的药物之间的关系。他们发现了他的惊讶。

靶向LSD1的药物会关闭蛋白质的酶功能。但是,这种功能并不像以前假设的那样对癌症的发展至关重要。Liau小组发现这些药物最终会切断LSD1与转录因子(GFI1B)之间的通讯。

尽管药物起作用是因为它们(有时)破坏了两种作用,但Liau组的新技术表明LSD1-GFI1B关系对于AML存活是最关键的。他们的发现也可以解释为什么某些AML亚型严重依赖LSD1。有了这些新信息,药物开发人员可以集中精力开展工作,加快药物开发,提供更有针对性的治疗。

接下来,Liau和他的团队计划研究LSD1上更多的肿块和漏洞,这是蛋白质最黑暗的角落,以及其他与癌症相关的蛋白质。根据Liau的说法,之前没有理解或理解为什么某些癌症对LSD1抑制剂敏感。现在,他的技术可以揭示新的和更有效的敏感性,从而导致更有效和更有效的癌症治疗方法。

Zhao说:“在过去,研究人员仅仅是通过从实验室里筛选细菌天然产物的方法来寻找新药。”但是,一旦我们对细菌基因组进行了全面测序,最后我们却只发现了一小部分在基因组中编码的天然产物。由于在实验室条件下,绝大多数生物合成基因簇不表达,或者表达水平非常低,这就是为什么我们称之为沉默基因,所以在这些沉默的基因簇中还有很多新的药物和新知识等待着我们去发现,他们才是真正隐藏的宝藏。”

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以张锋教授研究团队为主的科学人员报告了一种新的CRISPR效应分子Cpf1,该研究以“Cpf1 Is a Single RNA-Guided Endonuclease of a Class 2 CRISPR-Cas System”为题发表在2015年九月的cell杂志上。他们证明Cpf1具备介导强大的DNA干扰并且不同于Cas9的功能。

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最近,伊利诺伊大学的研究人员和新加坡科学技术研究机构的同事的一项新研究,使用CRISPR技术,在链霉菌属中开启了未表达的或“沉默的”基因簇,这是一类常见的细菌,它们自然状态下能够产生许多已经用作抗生素、抗癌剂和其他药物的化合物。该研究由化学与生物分子工程教授Huimin Zhao领导,相关结果已在《Nature Chemical Biology》杂志上发表。

CRISPR技术正在彻底改变我们研究细胞行为的方式,Wellcome Trust Sanger Institute的第一作者Kosuke Yusa博士说。我们开发了一个完整的库,可供其他研究人员用来研究任何基因的作用。我们可以为任何细胞或任何物种创建这种类型的文库。

该团队认为,只要可以选择适当的突变的测序数据,同时可以从期望的组织中获取祖细胞,就可以将血液肿瘤中的测试方法应用到其他类型的癌症。Zuzana Tothova博士说:“现场的人们对这些模型很渴望,我们正在分析正确的细胞背景,然后对疾病进行建模,我们期望其带有的遗传复杂性能够直接反映我们在患者中看到的一样,这在以前没有人可以完成,我们深信可能成为一个非常有益的工具。”

现在,在哈佛大学化学与化学生物学助理教授的自然化学生物学论文发表的一篇论文中,Brian

CRISPR在多个领域有很多令人振奋的应用,让基因编辑领域迎来了新一轮掘金热潮。

该团队设计了一个包含近90,000种这些指导RNA的文库,可用于靶向和修饰小鼠基因组中的每个基因,并创建突变干细胞文库。他们将突变体文库用于针对细菌毒素,梭状芽孢杆菌-毒素的遗传筛选,以更好地了解如何发生抗性:该药物对每种细胞类型都有毒性作用。

研究人员用azacitidine处理小鼠时,发现这些基因工程编辑细胞的反应与人类的数据预期相符:TET2突变细胞对药物有反应,而ASXL1突变的细胞对治疗有耐药性。该团队还发现,凝血酶基因SMC3中的突变增加了对药物的敏感性。

CRISPR在免疫学中的应用

研究小组发现,52种引导RNA中的50种成功切割了两种基因拷贝。这些工程化指导RNA的极高成功率似乎在许多细胞类型中是一致的,这使得它们创建了针对小鼠基因组中每个基因的指导RNA文库。

Ben Ebert解释说:“通过类遗传学的研究,我们知晓了哪些突变组合会导致癌症。 如果我们有足够的肿瘤测序数据,就可以确定突变基因以及那些突然发生的偶然突变组合。

CRISPR盘点

该团队现在将使用该库在癌细胞系中产生突变。癌症药物的一个主要问题是细胞通常可以迅速获得抗性并拒绝治疗。通过筛选通过突变失去所有功能的基因,该团队可以确定哪些基因参与获得对癌症治疗的抗性,从而找到临床目标。

来自哈尔滨工业大学生命学院的中国科学家黄志伟教授团队在Nature在线发表了题目为“The crystal structure of Cpf1 incomplex with CRISPR RNA”的研究论文。该项研究通过结构生物学和生化研究手段揭示了CRISPR-Cpf1识别CRISPR RNA 以及Cpf1剪切pre-crRNA成熟的分子机制。

Zhao说:“这是CRISPR技术较少探索的一个方向,大多数与CRISPR相关的研究都集中在生物医学应用领域,例如治疗遗传性疾病,但我们正在使用它来发现新的药物。我的实验室是第一个适应链霉菌属的CRISPR系统,在过去,在链霉菌属物种中打开或关闭一个特定的基因都是非常困难的,现在通过CRISPR技术可以对几乎任何的基因进行高效靶向操作。”

研究人员已经开发出一种方法,可以在小鼠基因组的所有基因中创建一个全面的突变库。该文库可用于检查每种基因在不同细胞类型中的作用。

张锋所在的Broad研究所和Wageningen大学的John van der Oost教授在Nature Biotechnology上发表题为“Multiplex gene editing by CRISPR–Cpf1 using a single crRNA array”的研究,实现了CRISPR的一项新突破,即利用CRISPR–Cpf1打造了一个多重化基因编辑系统。